当前，靶向蛋白降解（TPD）技术如 PROTAC、分子胶等高度依赖 CRBN、VHL 等少数几种 E3 泛素连接酶。然而，人类基因组编码的 E3 连接酶超过 600 种，许多疾病（尤其是特定恶性肿瘤）因缺乏这些常用 E3 的表达，或靶蛋白难以与之形成有效的三元复合物，导致现有降解剂策略失效。
上海生物医药技术大会近期了解到，为突破这一限制，暨南大学李正球研究员团队在《Angewandte Chemie》发表突破性研究，创新性地将具有反应活性的炔酰胺（ynamide）共价弹头整合到靶向蛋白的配体分子上，成功开发出依赖新型 E3 连接酶 RBBP7 的降解剂平台。该研究从 BTK 降解剂的机制解析出发，系统验证了该策略在降解多类靶点蛋白及克服临床耐药性方面的广泛适用性，为拓展 TPD 的应用边界奠定重要基础。
图片来源：医药魔方
化合物 YT-58 的诞生与优化
研究人员首先在已上市的 BTK 共价抑制剂伊布替尼的溶剂暴露哌啶环上引入炔酰胺弹头，得到化合物 YT-57。为优化设计，他们系统合成了包含不同弹头（如烯酰胺、马来酸内酯、氯乙酰胺、丙烯酰胺等）及不同长度连接链的衍生物进行对比。
在 Toledo B 细胞淋巴瘤细胞模型中，仅 1μM 浓度的 YT-57 处理 16 小时即可显著降解 BTK 蛋白（Dmax=83.2%），而其他弹头类型的化合物基本无效。进一步优化连接链长度后发现，具有 6 碳链的化合物 YT-58 降解活性最优，其 DC50 值低至 0.17μM，Dmax 为 83%。重要的是，YT-58 展现出比其母体抑制剂伊布替尼强约 20 倍的抗增殖活性。利用数据非依赖采集（DIA）技术的全细胞蛋白质组学分析进一步证实，YT-58 能选择性且高效地降解 BTK 蛋白。
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YT-58 的作用机制与核心 E3 连接酶的发现
研究人员深入探究 YT-58 的作用机制后发现，其介导的 BTK 降解严格依赖蛋白酶体途径。预处理蛋白酶体抑制剂硼替佐米或 MG-132 能完全阻断降解效应。同时，YT-58 能剂量依赖性地抑制 BTK 及其下游关键信号分子磷脂酶 Cγ2（PLCγ2）的磷酸化，其效果显著优于伊布替尼，这与观察到的强效抗增殖活性相符。
上海生物医药技术大会了解到，为揭示关键的 E3 连接酶，研究者采用共免疫沉淀 / 质谱联用（Co-IP/MS）和基于活性的蛋白质组学（ABPP）两种互补策略。结果一致将组蛋白伴侣蛋白 RBBP7（也称为 RbAp46）锁定为与降解过程密切相关的核心 E3 连接酶。
在细胞中敲低（knockdown）RBBP7 可有效逆转 YT-58 对 BTK 的降解作用。此外，YT-58 处理能显著增强 BTK 的多聚泛素化水平，而这种增强效应在 RBBP7 被敲低后明显受损。免疫共沉淀实验还证实，YT-58 能促进形成 RBBP7 – 降解剂 – BTK 三元复合物。
RBBP7 的关键修饰位点与平台普适性验证
关键位点研究发现，YT-58 通过其炔酰胺弹头共价修饰 RBBP7 蛋白第 97 位的半胱氨酸（C97），这是驱动 BTK 降解不可或缺的步骤。重组蛋白结合位点分析和基于活细胞的竞争性半胱氨酸定向 ABPP 均确认了 C97 是主要修饰位点。
点突变验证显示，将 RBBP7 的 C97 突变为丙氨酸（C97A）会显著削弱 YT-58 诱导的 BTK 降解，而其他半胱氨酸位点（C116、C166、C277）突变则无此影响。分子对接也显示 C97 位于蛋白表面，易于与 YT-58 发生共价结合。
研究人员对炔酰胺弹头的普适性进行验证发现，其可有效促进针对多种蛋白质（包括 CDK4、PDE5、PI3K、AKT、BCR-ABL、BRD4、EGFR L858R、EGFR L858R/T790M/C797）的降解剂开发。此外，将炔酰胺连接至泛激酶抑制剂 XO44 获得的化合物 YT-134，可在 AGS 细胞中同时降解 PI3K、Syk、AKT、GSK-3β 等多种激酶。
研究人员设计带有炔烃标签的探针（如泛激酶探针 YT-134、BRD4 探针 YT-172 等）进行 Pull-down / 质谱分析，结合 RBBP7 敲低实验，证实 RBBP7 是支撑该炔酰胺降解剂平台降解多种不同靶蛋白的核心 E3 连接酶。值得注意的是，普适性更强的泛激酶探针 YT-134 比选择性更强的 BRD4 探针 YT-172 捕获到更多的 E3 连接酶，提示其降解活性涉及更广泛的 E3 网络。
研究意义与应用前景
这项工作填补了 TPD 领域新型 E3 连接酶资源的空白，揭示了利用炔酰胺弹头共价招募 E3 连接酶的全新机制。开发的 “炔酰胺 – RBBP7” 降解剂平台展现出强大的模块化和普适性。此外，该平台中降解剂的分子量通常小于传统 PROTAC，有望改善其药物代谢动力学性质。上海生物医药技术大会认为，这一创新策略为快速开发针对 “难成药” 靶点和耐药靶点的下一代降解剂提供了强大工具，具有广阔的临床转化前景。
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