杜氏肌营养不良症（DMD）是一种致命的遗传性神经肌肉疾病，由X染色体上的DMD基因突变导致，大约每3500-5000名男性新生儿中就有1例。大多数DMD突变涉及一个或多个外显子缺失，破坏基因阅读框，导致无法产生具有功能活性的抗肌萎缩蛋白。DMD基因治疗的主要挑战来自于递送方式，与抗肌萎缩蛋白cDNA较大有关。

寡核苷酸介导的外显子跳跃疗法可以暂时恢复抗肌萎缩蛋白的开放阅读框结构，约有80%的DMD患者可以从中获益，但由于RNA的周转较快，需要频繁给药。原则上，靶向剪接调控元件的腺苷到次黄嘌呤（A-to-I）编辑也可以诱导外显子跳跃，因为在RNA加工过程中，次黄嘌呤会被视为鸟嘌呤。

来自昆明理工大学、北京大学和上海交通大学医学院的研究团队此前合作开发了一个RNA编辑平台LEAPER，中文名称为“利用内源性作用于RNA的腺苷脱氨酶（ADAR，实现A-to-I编辑的关键酶）进行可编程的RNA编辑”，目前已经升级为2.0版本，更加高效、持久。

研究团队此次使用LEAPER 2.0，通过环状ADAR招募RNA（circ-arRNA）实现外显子跳跃。在非人灵长类DMD模型中，单次治疗即实现了持久的抗肌萎缩蛋白功能性表达，并至少在1.5年内持续改善运动功能。在首次人体试验中，3例接受治疗的DMD患者实现了安全且剂量依赖性的外显子跳跃，伴有运动和心肺功能改善。研究结果发表在《细胞》杂志上[1]。

值得注意的是，此次研究实现的是外显子5和51的跳跃（分别可校正/处理外显子5和50的突变），而外显子51跳跃有望使13%的DMD患者获益。

研究人员首先验证了circ-arRNA诱导外显子跳跃的能力，他们发现，在ADAR1缺失时，circ-arRNA仍能诱导跳跃，这是由于高表达circ-arRNA产生空间位阻，在功能上模拟了反义寡核苷酸（ASO），而ADAR1存在时，外显子跳跃得到进一步加强。这种编辑依赖性与非依赖性结合的双重机制，使得LEAPER 2.0相较于传统ASO具有独特的优势。

研究人员还设计了双U6启动子串联结构，提高circ-arRNA的表达，其中v3构型效果最好，使外显子5跳跃效率最高可达到80%。后续实验均采用了2×U6-circ-arRNA151-v3。

在DMD非人灵长类动物模型（外显子5中2或5bp缺失，外显子50中7bp缺失）中，circ-arRNA有效诱导了外显子5和51的跳跃。外显子51的跳跃尤为重要，这是DMD患者最常见的热点突变，研究人员发现，靶向外显子剪接增强子（ESE）能够显著提高跳跃效率，且较长的circ-arRNA效果更好。此外，多点编辑也能够协同增强跳跃。

在递送的腺相关病毒（AAV）载体选择中，肌肉嗜性（Myo）AAV 4E在心肌和骨骼肌中的转导效率最高，注射后，circ-arRNA在多肌肉组织中表达，尤其在心肌中跳跃效率显著较高。由于心脏是DMD致死的主要器官，能在心肌中实现高效转导和外显子跳跃对临床转化至关重要。

两只外显子5缺失的DMD恒河猴在接受MyoAAV-circ-arRNA系统性注射后，2周时即可检测到外显子跳跃，且在1年的随访期内持续检测到。抗肌萎缩蛋白恢复至约10%野生型的水平，肌肉组织病理学显示纤维结构改善，肌肉损伤的指标水平显著下降，步行距离和活动量显著增加，步态明显改善。

尽管长期来看会出现针对抗肌萎缩蛋白的免疫反应，导致蛋白水平下降，但运动功能的改善仍然维持。

在外显子50缺失的DMD恒河猴中，治疗后长达1.5年的随访中，外显子跳跃效率高且稳定，抗肌萎缩蛋白水平长期维持，未出现下降，也未检测到针对抗肌萎缩蛋白的免疫反应，同样的，运动功能和心脏功能均保持良好的改善。

研究人员还在DMD患者来源的诱导性多能干细胞衍生的心肌细胞中验证了治疗的可行性，随后将验证推进到了DMD患者中。首次人体试验中，3名4-7岁的外显子50缺失的DMD患者接受了治疗，其中2例为低剂量，1例为较高剂量。

治疗诱导的外显子跳跃呈现剂量依赖性，且外显子跳跃效率与功能恢复呈正相关，患者的抗肌萎缩蛋白水平提升，运动功能（北极星移动评价量表[NSAA]）和心肺功能均有明显改善。治疗的安全性良好，仅出现轻微不良反应，无严重毒性。

近年来，尽管美国食品药品监督管理局（FDA）已经批准了一些针对DMD的ASO疗法，但是需要反复高剂量给药，并面临内体逃逸、核内递送受限以及剂量相关毒性等问题，患者仍需要更高效、更安全的治疗方法。这次研究中，基于AAV递送RNA编辑的治疗策略展现出了巨大潜力，并且初步验证了顺利的临床转化，或许将为DMD患者带来新一代疗法。

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